本文(wen)講述(shu)了如(ru)何將單柱(zhu)層析轉化為雙柱(zhu)層析（MCSGP）用于純化治療(liao)性寡(gua)核(he)苷酸，從(cong)而(er)顯著提高產(chan)(chan)品的收率(lv)以及生產(chan)(chan)效率(lv)。

采用(yong)2根相同的(de)層析柱，將第1根層析柱(zhu)洗(xi)脫(tuo)下的低純度組分回收到第2根層(ceng)析(xi)柱繼續純(chun)化，可同(tong)時保證(zheng)純(chun)度和收率。在本(ben)例(li)中，單柱層(ceng)析(xi)的收率僅(jin)為(wei)60%，而MCSGP在滿足(zu)目標純度要求前提(ti)下(xia)的收(shou)率則高達94%，顯著優(you)于單(dan)柱層(ceng)析。MCSGP工(gong)藝開發(fa)，是(shi)通過Contichrom HPLC系統的MCSGP向導軟(ruan)件來實(shi)現(xian)的。

介紹(shao)

化學(xue)合成的寡核苷酸(suan)已廣(guang)泛應用(yong)于(yu)DNA測(ce)序(xu)、聚合酶鏈反應（PCR）和(he)分(fen)(fen)子(zi)克(ke)隆。寡核(he)(he)苷酸(suan)的(de)(de)未開發(fa)潛(qian)力在(zai)于(yu)其以靶(ba)向方式(shi)修(xiu)飾(shi)基(ji)因表達的(de)(de)能力，從而為人類疾(ji)病(bing)帶來新(xin)的(de)(de)、有效的(de)(de)治療效果。經(jing)過幾十年的(de)(de)發(fa)展，寡核(he)(he)苷酸(suan)已成為繼小分(fen)(fen)子(zi)、多肽和(he)蛋白(bai)質藥物之(zhi)后的(de)(de)主要開發(fa)藥物之(zhi)一(yi)，預計寡核(he)(he)苷酸(suan)藥物將很(hen)快應用于(yu)以往(wang)無法治療的(de)(de)遺傳疾(ji)病(bing)上。鑒于(yu)寡核(he)(he)苷酸(suan)的(de)(de)合成成本較高，收率的(de)(de)增加(jia)將會對生(sheng)(sheng)產的(de)(de)經(jing)濟(ji)性產生(sheng)(sheng)重(zhong)大(da)好(hao)處。

治(zhi)療性寡核苷酸(suan)的生產過程(cheng)需要(yao)去(qu)除合成副產物，以(yi)使藥物純度符合要(yao)求(qiu)，一般需采用層(ceng)析方法進行精純，但這通常會使收率降低40-60%。作(zuo)為對策，可以將純度(du)較低的(de)產(chan)品單獨收集，并選擇再次(ci)進行層(ceng)析(xi)提純，但(dan)這會明顯降低生(sheng)產(chan)效率(lv)，而且會增加分(fen)析(xi)檢測的(de)工作(zuo)量。因(yin)此，迫切(qie)需要有更(geng)先進的(de)層(ceng)析(xi)手(shou)段(duan)來提高收率(lv)，并替代現有的(de)層(ceng)析(xi)方(fang)法。

MCSGP（Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification）可同時保(bao)證高純度和高收率，有結果(guo)表(biao)明，與(yu)單柱層析相比，MCSGP可(ke)在滿足目標純度的前(qian)提下，使產品收率提高至(zhi)90%。因此，MCSGP克服了單(dan)柱(zhu)層(ceng)析時收率(lv)和(he)純(chun)度無法兼得的(de)(de)(de)問(wen)題，并且由于收率(lv)的(de)(de)(de)提高，通常還可保證更高的(de)(de)(de)生產效(xiao)率(lv)和(he)更低的(de)(de)(de)溶劑消(xiao)耗量(liang)。

MCSGP原理

圖1. 傳統單柱層析（左）：重疊組分被舍棄或暫時保(bao)留以再次進行層析。

MCSGP（右）：將(jiang)重疊組分進行循(xun)環回收，不斷去除雜質(zhi)，收集純(chun)產品(pin)。

與(yu)單柱層析不同，MCSGP是使用2根相同(tong)的(de)層(ceng)析柱進行連續層(ceng)析（圖1）。然而，兩者的分離原則是基本一致的，即(ji)在(zai)層析過程中，都將樣(yang)品分離得到3部(bu)分(fen)(fen)(fen)：純產(chan)物(wu)(wu)、雜質(zhi)(zhi)和(he)產(chan)物(wu)(wu)的重疊(die)組分(fen)(fen)(fen)、僅含雜質(zhi)(zhi)的部(bu)分(fen)(fen)(fen)。收集純產(chan)物(wu)(wu)部(bu)分(fen)(fen)(fen)，舍棄或重新(xin)處理含有(you)雜質(zhi)(zhi)的重疊(die)組分(fen)(fen)(fen)。如果將重疊(die)組分(fen)(fen)(fen)舍棄，會(hui)使有(you)價值的產(chan)物(wu)(wu)發生損失。對重疊(die)組分(fen)(fen)(fen)進行(xing)再處理會(hui)積(ji)累雜質(zhi)(zhi)，因此適用(yong)性受(shou)到限(xian)制。此外，將重疊(die)組分(fen)(fen)(fen)暫時保留并再次進行(xing)層(ceng)析會(hui)降(jiang)低整體生產(chan)效(xiao)率(lv)。MCSGP通過內部(bu)回(hui)收（recycle）重疊(die)(die)組分(fen)(fen)(fen)，反復分(fen)(fen)(fen)離(li)雜(za)質和純(chun)產物，從而同時保證純(chun)度(du)和收率。組分(fen)(fen)(fen)的(de)回收過程是(shi)自動(dong)完成的(de)，不需(xu)要進行(xing)離(li)線分(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)。重疊(die)(die)組分(fen)(fen)(fen)從一個層析(xi)(xi)柱轉移到另一個層析(xi)(xi)柱，并在每(mei)個cycle中會有新的(de)(de)樣(yang)品再(zai)次上柱。這樣(yang)可以確保連(lian)續操作，并在不影響純(chun)度的(de)(de)情況(kuang)下獲得高收率的(de)(de)產品。

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材料和方法

在(zai)30%氨水中制(zhi)備治療(liao)性寡(gua)核苷(gan)酸，最終濃度(du)為(wei)45 g/L，并通過反相(xiang)HPLC測(ce)得純度為73.8%（圖2）。

圖2. 上樣(yang)樣(yang)品反相層析分析圖譜

反相層(ceng)析方法：采用(yong)單柱層析和雙柱MCSGP純化寡核(he)苷(gan)酸，兩種(zhong)模式均(jun)通過Contichrom HPLC 30層析系統進行操(cao)作，并記(ji)錄280 nm處紫外吸收值。使用2個內(nei)徑0.77 cm、柱床高(gao)度10 cm的Hiscreen Q Sepharose FF柱(zhu)（柱(zhu)體(ti)積為2×5 mL）。溶劑為25 mm NaOH（A相）和(he)25 mm NaOH+2 M NaCl（B相(xiang)）。對于(yu)單柱(zhu)層析，每次上樣量為每mg填料上樣(yang)1 mL。產(chan)品洗脫采用在(zai)線性梯度從10%B到90%B進(jin)行24 CV（柱體(ti)積）。共進行(xing)3次單柱層析操(cao)作，1次作為(wei)性能基準(zhun)（Benchmark），2次作為MCSGP設計的基礎。

圖(tu)3. ChromIQ軟件Batch向導(dao)界面

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單柱(zhu)（Batch）方(fang)法是使用Batch向導創建的，如(ru)圖3所(suo)示。表(biao)1為(wei)單柱層析(xi)參數。

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表1. 單柱層(ceng)析參數(shu)(shu)比較。方法名稱中的數(shu)(shu)字（150&300）對應洗脫流速。

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Benchmark使(shi)用(yong)20cm床高(gao)進行。運行MCSGP時，使用(yong)10cm床高的(de)層析柱(zhu)2根，以(yi)保證在(zai)recycle步(bu)驟中2柱(zhu)串聯(lian)時(shi)的總高度(du)不(bu)超過20cm。因(yin)此，僅運行(xing)單個10 cm層析柱的步驟(zou)（洗脫、清(qing)洗、CIP、再生）可(ke)以在2倍至3倍(bei)的(de)線(xian)性流速(su)下進(jin)行，而不超過層析柱(zhu)的(de)壓(ya)力限制。這(zhe)將會轉化為更(geng)高的(de)生(sheng)產效率。采(cai)用10cm層析柱進行單柱層析，洗脫流速為300cm/h（Batch Run 300），作為MCSGP設(she)計的基礎。分(fen)段收集，并采用HPLC對(dui)各分段組分進(jin)行分析檢測(ce)，以生成準確的純度曲線，從而快(kuai)速實施(shi)MCSGP。

單柱層(ceng)析結果

圖(tu)4和圖6為單(dan)柱(zhu)層析圖譜。使用(yong)反(fan)相HPLC測(ce)定(ding)各洗(xi)脫組(zu)分(fen)的純度(du)，并(bing)用超微量分(fen)光光度(du)計(ji)測(ce)定(ding)各洗(xi)脫組(zu)分(fen)的濃(nong)度(du)（圖5和圖7）。

圖4. Benchmark：Contichrom系統單柱(zhu)層析圖譜（黑(hei)色：A280nm；藍色：電導率）

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圖5. Benchmark：洗脫組分檢(jian)測(ce)結果

圖6. Batch Run 300（用(yong)于MCSGP設計）：Contichrom系統單柱層析(xi)圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導率）

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圖7. Batch Run 300：洗脫組分檢測結果

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這兩種單(dan)柱層析的詳細過程參數比較見(jian)表(biao)5。在要求目標純度(du)>91%的情況(kuang)下(xia)，與Benchmark的20cm床高相比(bi)，采用10cm床高(gao)可產(chan)生更高(gao)的生產(chan)效率，這是(shi)因為10cm床高(gao)(gao)可使用更高(gao)(gao)的線性流速。然(ran)而，Batch Run 300的(de)收率會比Benchmark低(di)5%，這是因為滿足純度(du)要求的收集范圍較窄。

MCSGP設計(ji)

可以單柱層析結果為基礎，通過MCSGP向導生成雙(shuang)柱(zhu)MCSGP方法（見圖8）。Contichrom系統(tong)的ChromIQ軟(ruan)件可提供MCSGP向導功能。MCSGP采用與單(dan)柱層析(xi)(xi)相(xiang)同的(de)層析(xi)(xi)柱、溶液體系(xi)和相(xiang)同的(de)層析(xi)(xi)方案。

圖8. MCSGP向導：以單(dan)柱層析圖(tu)譜為(wei)基礎，整(zheng)個MCSGP設計過程可(ke)在15分鐘內完成。

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在STEP1中，需要將單柱(zhu)層析圖譜加載(zai)到MCSGP向導（圖9）。在STEP2中(zhong)，需要將檢測(ce)得(de)到的各洗脫(tuo)組(zu)分純度和濃(nong)度結(jie)果(guo)與(yu)單柱層析圖譜進行疊加。

圖(tu)9. MCSGP向導界面

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在STEP3中(zhong)，通過拖動不同顏色區(qu)域的(de)邊界，將(jiang)層析圖譜(pu)劃分為純產(chan)物（Product）、重疊組(zu)分(fen)（Recycle）以及雜(za)質（Waste）（圖(tu)9和圖10）。可由系統軟件模擬計算得(de)到收集樣品(pin)的純度，并(bing)可根(gen)據(ju)區域劃分(fen)的變化自動進(jin)行更新。

圖10. MCSGP向導(dao)STEP3示(shi)意圖(tu)，其中(zhong)包括Recycle區域（A-B為(wei)藍(lan)色，C-D為綠色）和Product區域（B-C為(wei)紅色）

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圖(tu)9和(he)圖(tu)10突出顯示了三個區(qu)域，分(fen)別為1個(ge)Product區域（紅色）和2個Recycle區域（藍色(se)和綠色(se)）。MCSGP過程具(ju)體(ti)如下：

A：產品洗脫(tuo)出(chu)峰時(shi)開始進行(xing)回收（Recycle）；

B：產品純度達到90%時(shi)開始收集目標物(wu)（Product）；

C：產品純度低于(yu)90%時結束收集(ji)目(mu)標物，并再(zai)次開始回收（Recycle）；

D：產品洗脫完(wan)畢，結束(shu)回收。

在STEP4中，可設(she)定(ding)層析(xi)柱規格及上樣體積。MCSGP所使(shi)用的(de)2根層(ceng)析柱(zhu)的規格型號(hao)、裝填高度均與單(dan)柱(zhu)層(ceng)析時相同。MCSGP向導會根據紅色(se)區域(yu)與藍色(se)、綠(lv)色(se)區域(yu)的(de)面積比例，自(zi)動調整上(shang)樣量(liang)，確(que)保工藝穩定。

在STEP5中，輸入與單(dan)柱(zhu)層(ceng)析(xi)相同的層(ceng)析(xi)工藝參數，MCSGP向導會自動(dong)計算出稀(xi)釋因子，從而保證回收組分(fen)被稀(xi)釋后可(ke)與(yu)層析柱再次結合(he)。

在STEP6中，MCSGP向導可以模擬計算出相關(guan)工藝(yi)參數并(bing)進行顯示，包(bao)括(kuo)產品純度、生(sheng)產效率、上樣量(liang)、溶液消耗(hao)量(liang)以及收集樣品的濃度，并(bing)可設定cycle次數。此外，MCSGP向導還(huan)可自動生(sheng)成(cheng) start-up和shut-down方法。整個MCSGP設計(ji)過(guo)程可在15分鐘內完成。

分別(bie)以(yi)150 cm/h、300 cm/h和450 cm/h的(de)洗脫流速進行了3次(ci)MCSGP運行，以保證在層(ceng)析(xi)柱(zhu)耐壓范圍內進行工(gong)藝測試，見表(biao)2。

表2. MCSGP方法參數(shu)比較。方法名稱(cheng)中的(de)數(shu)字（150、300和450）對應洗脫流速(su)。

MCSGP操作

圖(tu)11為MCSGP Run 150層(ceng)析圖(tu)譜，此為MCSGP的典型圖譜(pu)。層(ceng)析圖譜(pu)顯示(shi)了2根層析柱可交(jiao)替進行(xing)洗脫操作。2根層析柱在每個(ge)cycle中各會(hui)完成一(yi)次洗脫。

ChromIQ軟(ruan)件還可以(yi)將連續過程（如MCSGP）的多(duo)個cycle進行疊加(jia)（圖(tu)12）。疊(die)加圖譜表明從cycle2開始(shi)進入穩態。

圖11. MCSGP Run 150層(ceng)析圖(tu)譜，共顯示(shi)5個(ge)cycle

圖12. MCSGP純化寡核(he)苷酸的疊加圖譜，共(gong)5個cycle。該圖顯示出(chu)洗脫曲線的變化(hua)很(hen)小(xiao)，洗脫峰(feng)也很(hen)相似。第1組洗脫產物來自柱2（藍色曲線），第2組洗脫產(chan)物來自柱1（紅色(se)曲(qu)線）。

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每個(ge)cycle會進行2次(ci)收集，每(mei)柱(zhu)各1次。檢測(ce)表明，每(mei)個cycle的產量、濃(nong)度、純度均一致。圖(tu)13為MCSGP的5個cycle分析(xi)圖譜(pu)疊加。HPLC檢測結果(guo)顯示(shi)，三種不(bu)同洗脫流(liu)速的MCSGP產品純度均高于91%的目標閾(yu)值，每(mei)次均運行5個cycle，見表4。

圖13.寡核苷(gan)酸反相(xiang)分(fen)析圖譜，5個cycle的(de)疊加顯示出一致的(de)產品質量。此圖為MCSGP Run 150的結果(guo)，三種不同洗脫流速(su)的MCSGP檢測結果相似。

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表3為(wei)MCSGP Run 300的5個cycle工藝參數與MCSGP向導模(mo)擬(ni)計算結(jie)果(guo)的對比。實測(ce)數(shu)據與模(mo)擬(ni)計算結(jie)果(guo)接近，說明可(ke)以在單柱(zhu)層析結(jie)果(guo)的基礎(chu)上，將MCSGP向(xiang)導作為數據預(yu)測工具使用(yong)。

表(biao)3. MCSGP Run 300工藝參(can)數(shu)與MCSGP向導模(mo)擬計算結(jie)果的對(dui)比

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單柱層析與MCSGP工藝對(dui)比

從(cong)收率(lv)、純度、生(sheng)產效率(lv)、產品濃度和溶(rong)液消耗等方面對單柱層析和雙柱MCSGP進行(xing)了計算和(he)比較，MCSGP在各方(fang)面均表現出(chu)明顯優勢（表5）。

將采用(yong)20cm床高的Benchmark與采用10cm床(chuang)高的(de)單柱模式(shi)（Batch Run 150和Batch Run 300）進(jin)行了(le)對比，與預測情況(kuang)相同(tong)，較(jiao)短層析(xi)柱的(de)(de)收(shou)率會明顯低(di)于較(jiao)長(chang)的(de)(de)層析(xi)柱，這是因為較(jiao)短的(de)(de)層析(xi)柱分辨率較(jiao)低(di)。然而，如(ru)果不考(kao)慮收(shou)率，就生產(chan)效(xiao)率而言(yan)，較(jiao)短的(de)(de)層析(xi)柱優勢更明顯，尤其是在使(shi)用較(jiao)高流速時(shi)。與采(cai)用20cm床高的(de)Benchmark相比，采(cai)用10cm床高的單柱模(mo)式（共2根層析柱，累(lei)計床(chuang)高20 cm）收率會從60%降至55%，但生產效率會(hui)提高3倍。

MCSGP的(de)主(zhu)要優點是(shi)在目標純(chun)度大(da)于91%的前(qian)提下，與所有單柱模式相比(bi)，產品收率可顯著(zhu)提升。按照測試(shi)流速，在92%純(chun)度要求前提下(xia)，MCSGP收(shou)率(lv)可比Benchmark單柱(zhu)模式(shi)高出50-57%，詳見表5、圖(tu)12和圖14。MCSGP收率也顯著(zhu)優于10cm床高的單柱模式。

在生(sheng)產效(xiao)率方(fang)面，MCSGP的優點是在(zai)洗脫時(shi)可運行比(bi)Benchmark更高的流速(su)，這(zhe)是因為柱(zhu)床(chuang)高度降(jiang)低了一半，層析柱(zhu)反壓更低。這(zhe)意味著，與Benchmark相比，MCSGP可使生產效率翻倍，而保證收率仍(reng)高于90%（圖15）。將MCSGP直接與10cm床高的單柱模(mo)式進(jin)行比較，發現10cm床(chuang)高的(de)單柱模式生產效率更高。首先，與MCSGP相同，10cm床高的單柱模式支(zhi)持采用更高的流速。其次，與MCSGP不(bu)同，10cm床(chuang)高的單(dan)柱模式沒有2柱串聯的步驟，因此避免了(le)采用較(jiao)低流速的過(guo)程(cheng)。最后(hou)，由于MCSGP的(de)recycle功能，每cycle的新(xin)樣品上樣量都(dou)會受(shou)限，本例中，每(mei)cycle的新樣品上樣量約為單柱模式的50%。實際上，對于許多大規(gui)模的寡(gua)核(he)苷(gan)酸生產來(lai)講，收率增加5%比生產效率提高(gao)3倍更(geng)具有經濟意(yi)義(yi)，這是因為寡核苷酸的合(he)成(cheng)成(cheng)本很高（見表 5 Benchmark與Batch Run 300對比）。事實上，由于MCSGP在提高(gao)收(shou)率(lv)方面優勢明(ming)顯，預計提高(gao)收(shou)率(lv)部分所產生的(de)價值將迅速抵消購買連續流設備的(de)成本投入（見文獻Müller-Sp?th, T., & Bavand, M. (2019). Purification of Synthetic Peptides by Countercurrent ?Chromatography (MCSGP)-Economic Evaluation. Pharmaceutical Engineering,? 39(2), 68–77）。因此(ci)，應該把提高純化(hua)收率作為本研究的主要(yao)目(mu)的。

表4. 三(san)種(zhong)不同洗脫流速MCSGP結果(guo)對比(bi)

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表5. 單(dan)柱層析(xi)與MCSGP運行(xing)過程(cheng)對比

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圖14. MCSGP（三角形）和單柱層(ceng)析（圓形）帕累托(tuo)曲線。

該圖表(biao)明(ming)，MCSGP有效克服了單柱層(ceng)析時收率和純(chun)度無法兼得(de)的問題(ti)。

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圖15. MCSGP（三角形(xing)）和單柱層析（圓形(xing)）收率-生(sheng)產效率對比圖

總(zong)結

與單柱層析相比，MCSGP在寡(gua)核(he)苷酸純化方(fang)面具有明顯優勢。主(zhu)要包(bao)括：

1.?????? MCSGP可(ke)使寡(gua)核苷酸收率(lv)提高(gao)50%以(yi)上。在(zai)要求產(chan)品純度為92%時（目標純度(du)大于91%），單柱層(ceng)析的收(shou)率為60%，而MCSGP的收率可(ke)高達(da)90%。

2.?????? 寡核苷酸收(shou)率的提(ti)高可顯著降低上游寡核苷酸合成的工作量及成本投入。

3.?????? 與Benchmark相比，MCSGP可(ke)使生產效率翻倍。

4.?????? 大(da)幅(fu)度減(jian)少(shao)了送(song)檢樣品數(shu)量(liang)。（MCSGP每(mei)cycle需要上(shang)樣2次，但僅產生(sheng)1個送(song)檢(jian)樣品(pin)，而單(dan)柱(zhu)層(ceng)析每(mei)次(ci)上樣都會產生多個送(song)檢(jian)樣品(pin)。）

5.?????? 其它工(gong)藝參數與(yu)單柱層析(xi)接近。

通過MCSGP提高生(sheng)產效(xiao)率(lv)，可應用于多種(zhong)生(sheng)產方式：

1.?????? 可采用更小(xiao)規格的(de)(de)層析柱，在相(xiang)同的(de)(de)時間內，完成與單柱層析相(xiang)同的(de)(de)生產任務；

2.?????? 可(ke)采用與單柱層析相同規格的層析柱，在更(geng)短的時間內完(wan)成生產任務；

3.?????? 層析填(tian)料(liao)體積相同時(shi)，可(ke)在相同時(shi)間(jian)內獲得(de)更多的產品。

層析(xi)系統介紹

Contichrom HPLC：Contichrom HPLC是一套多(duo)用途的制備(bei)型實驗(yan)室級層(ceng)(ceng)析系統(tong)，可運(yun)行多(duo)種單柱和雙柱層(ceng)(ceng)析。ChromIQ是Contichrom系(xi)統的(de)操作軟件，其中包括(kuo)MCSGP向導功能。

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EcoPrime Twin HPLC ：EcoPrime Twin HPLC為生產型連續流(liu)層析系統(tong)，可在GMP條件(jian)下(xia)運行MCSGP功能，滿足MCSGP工藝的(de)有效線(xian)性放大。

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